"Старость не защищает от Любви,
но Любовь защищает от старости"

© Коко Шанель

Пцр что это


сферы применения, подготовка к исследованию, анализы на инфекции

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» - ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) - уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории


Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами - изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

  1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
  2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
  3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.
Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.
Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).


Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

пцр диагностика на Инфекции:

www.labquest.ru

ПЦР с обратной транскрипцией — Википедия

Материал из Википедии — свободной энциклопедии

Текущая версия страницы пока не проверялась опытными участниками и может значительно отличаться от версии, проверенной 28 декабря 2016; проверки требуют 5 правок. Текущая версия страницы пока не проверялась опытными участниками и может значительно отличаться от версии, проверенной 28 декабря 2016; проверки требуют 5 правок. Запрос «RT-PCR» перенаправляет сюда; если вас интересует ПЦР в реальном времени (Real-time PCR), или количественная ПЦР (quantitative PCR), см. ПЦР в реальном времени. Одноступенчатая против двухступенчатой RT-PCR Пробы Такмана

В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (англ. reverse transcription polymerase chain reaction) принято обозначать как ОТ-ПЦР (англ. RT-PCR). ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты (РНК).[1]

Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции (ОТ, англ. RT, reverse transcription) в комплементарную ДНК (cDNA) и далее амплифицируют уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционную ПЦР. RT-PCR не следует путать с ПЦР в реальном времени (англ. Real-time PCR, Q-PCR), которую также иногда неверно сокращают как RT-PCR.[2]

Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют обратную транскриптазу:

  • 1. Реакция первой цепочки:
    Комплементарная ДНК (cDNA) образуется на матрице мРНК из dNTP ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК-праймером и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37 °C.
  • 2. Реакция второй цепочки:
    После того как обратная транскрипция закончена и образована cDNA на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР.

После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности.[2]

ОТ-ПЦР используется для обнаружения молекул РНК в образце с заранее известным участком последовательности, комплементарным праймеру. Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК.

Примером являются РНК-вирусы, такие как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который является ретровирусом и поэтому использует фермент обратную транскриптазу ВИЧ (англ. HIV-Reverse Transcriptase) для синтеза вирусной ДНК, которая затем встраивается в геном хозяина.

Также ОТ-ПЦР широко используется для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов[3].

  • Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.

ru.wikipedia.org

как проводят анализ, когда назначают.

Еще совсем недавно, каких-нибудь десять лет назад при диагностике заболеваний, передающихся половым путем, в ходу были простые и бюджетные методики лабораторных исследований.

Они якобы давали исчерпывающее представление о возбудителях половых инфекций и их наличии в организме человека.

Трихомонаду и гонококк было принято искать в мазках.

Окрашены они были самыми разными красителями под самым простым световым микроскопом.

Разве что лаборант мог плеснуть иммерсионного масла для лучшей подсветки.

Никого особо не смущало, что красители меняют форму и подвижность тех же трихомонад.

После чего отличить их от патологически измененной клетки эндотелия весьма проблематично.

Хламидий, вернее антитела к ним, титровали из крови.

Уреаплазмы и микоплазмы выращивали колониями на твердых и жидких средах, по неделе ожидая, пока колонии заколосятся.

В целом их считали условными патогенами.

И предпочитали не замечать, пока не расцветала клиника урогенитальной инфекции или не вставал вопрос о бесплодии.

Метод ПЦР диагностики стал революцией в лабораторном деле.

Раз и навсегда она решила проблему сжатых сроков диагностического поиска.

Максимально приблизила ответ на вопрос “Что вызвало воспаление?” к первому визиту пациента к специалисту.

Сегодня никого не надо заставлять дожидаться ответов анализов по неделе.

И с замиранием сердца готовиться к худшему, временно вместо антибактериального или противовирусного лечения принимая успокоительные.

Содержание статьи

  •  Суть метода ПЦР
  •  Спектр применения ПЦР анализа
  •  Сбор материала для ПЦР анализа
  •  Что делать перед ПЦР исследованием
  •  Какие врачи берут ПЦР-анализы
  • Кому и когда необходим ПЦР анализ
  •  Особенности ПЦР диагностики
  •  ПЦР-диагностика: расшифровка
  •  Плюсы и минусы анализа ПЦР
  •  Вариации ПЦР методики
  •  Что означает ответ в бланке ПЦР

 Суть метода ПЦР

Если доступно отвечать на вопрос “ПЦР-анализ, что это такое?”, — то придется вспомнить следующее.

Всякое живое существо несет в себе наследственную информацию, которую получает от родителей и передает детям.

Это либо РНК (рибоксинуклеиновая кислота), либо ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота).

Либо и то, и другое, в одном существе в разных вариантах.

РНК – это одна цепочка нуклеиновых кислот, ДНК – две.

Собственно, вот эти цепочки или их обломки и ищут, когда ведется ПЦР-диагностика инфекций.

  • Так как генетический код уникален для разных видов инфекционных агентов, попасть впросак, как при световой микроскопии, то есть, принять один вид паразита за другой не представляется возможным. Такая точность называется сто процентной специфичностью.
  • Второй критерий, подтверждающий точность диагностики, – это чувствительность ПЦР-анализа. Она тоже не подкачала и составляет сто процентов.

По сути, этот параметр показывает, сколько микробов или вирусов, или их фрагментов должно попасть в образец для исследования, чтобы анализ мог отреагировать на их присутствие.

Когда проводят ПЦР-диагностику, для успешности достаточно даже обломков наследственного материала.

Это позволяет зафиксировать присутствие возбудителя в крови даже в прошлом (до полугода от того момента, как лекарства успешно справились с заразой).

Это делает ПЦР уникальным ретроспективным методом.

Для оценки ранее существовавших, но уже утраченных поводов для воспалений, с последствиями которых приходится иметь дело клиницистам (например, бесплодием).

То есть имеется бесплодная пара и все еще не ясно, в чем заключается причина проблемы.

На данный момент оба клинически здоровы, за исключением, скажем, изменений в спермограмме у мужчины.

С помощью ПЦР можно установить, какие именно инфекции присутствовали в организме мужчины за последние полгода и предположить, что именно они стали камнем преткновения.

 Спектр применения ПЦР анализа

Какие инфекции можно проверить ПЦР-анализом?

Да практически любые.

Острые, хронические, рецидивирующие, даже ранее существовавшие.

Бактериальные, грибковые, вирусные, протозойные.

Любой инфекционный агент, имеющий геном, можно засечь методом амплификации нуклеиновых кислот.

В половых и мочевыводящих путях, ухе, горле, носу, дыхательной системе, ЖКТ.

С любого участка тела, с которого удастся получить образец клеток.

Это дает методике очень широкий спектр применения.

Что касается забора образцов для исследования, пожеланием врачей-лаборантов остается предоставление тех тканей, в которых подозревается наличие возбудителя.

Хотя кровь и продолжает считаться универсальным материалом для анализа, не стоит пренебрегать исследованиями того, что получено непосредственно с “места событий”.

  • Если воспаление развивается в уретре или вышележащих мочевых путях предпочтительны соскобы эндотелия из нее или моча.
  • При наличии вульвита – соскоб влагалищного эндотелия, цервицита – слизистой из шеечного канала.
  • Можно подвергнуть анализу простатический секрет, сперму, соскобы из прямой кишки, отделяемое конъюнктивы глаз, соскобы и мазки из ротоглотки, спинномозговую жидкость. И это только в урологии и гинекологии.
  • Реакцию используют во фтизиатрии для верификации возбудителей нетипичных пневмоний и туберкулеза.

Исследование может проводиться в день первого обращения к врачу, если будет произведен забор образцов.

Ответы выдаются в течение первых двух суток.

При необходимости в течение нескольких часов.

Таким образом, метод — экспресс-диагностика, сильно сокращающая сроки лечения и ускоряющая его начало.

 Сбор материала для ПЦР анализа

Стандартно выполняются соскобы и мазки у женщин на гинекологическом кресле.

У мужчин при урологическом осмотре.

Чаще всего это все же соскоб эндотелиальных клеток мочевыводящих путей.

При отсутствии воспалительных изменений болей при манипуляции нет.

Воспаленные слизистые более подвержены микротравмам и могут давать незначительные контактные кровотечения.

С ними ничего не нужно делать, проходят самостоятельно за несколько часов или суток.

Для женщин сначала выполняется забор проб из уретры, затем из влагалища и наконец из шеечного канала.

  • Цервикальный материал забирается тампоном-щеточкой или стандартным ватным тампоном, с которого пробу переносят в пробирку с транспортной средой.
  • Из уретры забор предусмотрен тампоном или бактериологической петлей из пластика.

Они вводятся на пару сантиметров и вынимаются с легким нажимом на стенки уретры.

Полученный образец также переносится в пробирку.

  • Соскоб из влагалища берется с использованием стерильного ватного тампона. При выборе участков забора образца предпочтение отдается измененной слизистой или заднему своду влагалища.

У мужчин соскоб предполагает использование урологического зонда.

Он вводится в мочеиспускательный канал на глубину 3-4 сантиметра и вынимается с легким нажатием на стенки уретры.

Образцы других биологических жидкостей и тканей берутся в лаборатории или на приеме у профильного специалиста.

  • Венозная кровь натощак утром или после шестичасового голодного промежутка в процедурном кабинете.
  • Сперма – в лаборатории собирается пациентом.
  • Мазки из прямой кишки, ротоглотки, отделяемое конъюнктивы – средним мед персоналом на приеме у врача.
  • Простатический секрет – на приеме у уролога после массажа простаты.
  • Для мочи предусмотрен сбор утренней порции в объеме 30-50 миллилитров после гигиенического туалета половых органов.
  • Мокрота собирается утром после питья небольшого количества теплой жидкости при отхаркивании в стерильную аптечную емкость.
  • Спинномозговая жидкость (ликвор) – при проведении пункции.

 Что делать перед ПЦР исследованием

Очень часто у пациентов клиник и лабораторий возникает масса вопросов по поводу того, как готовиться, ПЦР-анализ требует ли специальных мероприятий от пациента.

Чтобы исследование стало максимально достоверным, желательно соблюдение некоторых условий.

Подготовка к ПЦР крови и мазка включает следующие пункты.

  • За две недели не должны употребляться антибактериальные, противовирусные и противопротозойные лекарственные средства.
  • Перед тем, как берется мазок на ПЦР анализ, исключаются антисептики для местного применения. В том числе, в средствах для интимной гигиены.
  • Перед забором материала из мочеиспускательного канала следует не мочиться 2-3 часа до мероприятия.
  • Перед забором крови нельзя употреблять пищу, по крайней мере, на протяжении шести часов.
  • Перед исследованием эякулята секс противопоказан двое суток.

 Какие врачи берут ПЦР-анализы

Обычно это гинеколог, уролог и венеролог.

То есть специалисты, которым требуется чаще других сталкиваться со скрытыми вариантами или носительством инфекций, лечение которых нужно начинать как можно скорее.

Не менее редко в ПЦР нуждаются инфекционисты.

Особенно в случаях внутриутробных инфекций или других инфекционных процессах невыясненной этиологии.

Сколько по времени делается ПЦР-анализ, зависит от возможностей лаборатории и срочности, с которой нужно получить ответ.

Обычно это не более трех рабочих дней.

Кому и когда необходим ПЦР анализ

Стандартными ситуациями, требующими применения данного обследования, становятся:

  • Выявление при клиническом осмотре или в жалобах пациента признаков островоспалительных изменений мочеполового тракта.
  • Для верификации причины воспалительных явлений.
  • У пациентов с бесплодием для уточнения причин.
  • В ходе планирования беременности.
  • Во время наступившей беременности для женщин.
  • Планирование экстракорпорального оплодотворения.
  • Необходимость проконтролировать эффективность терапии венерического заболевания или носительства возбудителя ИППП (по истечении месяца от окончания терапевтического курса).
  • Необходимость первичного обследования для тех, у кого за последний год было два и более сексуальных партнеров. Подобный скрининг нацелен на выявление скрытых инфекций.

 Особенности ПЦР диагностики

Проявляемая анализом высокая чувствительность к половым инфекциям позволяет работать методикой при разных видах возбудителей.

Лучше всего выявляются уреаплазмы, микоплазмы, хламидии, а также вирусы папилломы, герпеса, гепатитов, ВИЧ, цитомегаловирус.

Есть возможность применить диагностическую тактику сразу после заражения.

В ходе исследования амплификатор периодически нагревает и охлаждает образцы с добавленными ферментами-ускорителями в пробирках.

На первом этапе расщепляют двойную цепочку ДНК искомого возбудителя.

Затем на ее короткий участок садятся два праймера (затравки) из стандартного набора, уникальные для данного возбудителя.

Для образования гибрида между матричной ДНК и праймером требуется повысить температуру.

После этого происходит удвоение участков ДНК инфекционного агента и их выделение электрофорезом и выявление.

В дальнейшем участок можно изучать и типировать.

Методика незаменима в ситуациях, когда возбудители не поддаются культуральному выращиванию, ускользают от серодиагностики.

Цена мазка и крови может несколько отличаться в разных клиниках и лабораториях.

Целесообразно, чтобы забор материала проводился в клинике, оснащенной лабораторными мощностями.

Это позволяет ограничить загрязнение образцов посторонними микробными примесями.

 ПЦР-диагностика: расшифровка

Анализ совмещает в себе достоинства качественного и количественного теста.

Качественные характеристики отражают в бланке отметками “не обнаружено”.

То есть ответ отрицательный

Или “обнаружено” при положительной пробе.

  • Отрицательному ответу соответствует ситуация, когда нет даже намеков на удвоение нуклеиновых цепочек даже при стимуляции ферментами-ускорителями. Это происходит, когда РНК или ДНК, характерные для искомого возбудителя, отсутствуют либо их количество находится за порогом чувствительности теста.
  • Положительные результаты приходят, если имеется разгар клинических проявлений инфекционного процесса или носительство инфекционного агента. После лечения половой инфекции положительный результат регистрируется на протяжении первых девяти месяцев в среднем (могут быть сокращения сроков до трех или удлинение до двенадцати месяцев).

Ложноотрицательный и ложноположительный анализ тоже возможны.

Сразу после лечения и в течение шести-девяти месяцев после его окончания диагностика может свидетельствовать о присутствии генетической информации возбудителя в крови или других средах и тканях организма.

По истечении указанного срока анализ становится отрицательным.

 Плюсы и минусы анализа ПЦР

  • Достоинством методики является то, что в отличие от культуральных методов исследования, для выявления инфекции не требуется накопления агентов в организме. А в отличие от серологических анализов крови нет необходимости выжидать выработки антител к антигенам бактерий, вирусов, грибов или простейших. От момента заражения можно проводить тестирование. Идеальным можно считать ситуацию, когда интерпретация результатов проводится в день обращения к врачу. ПЦР выигрывает сравнение с ИФА и посевом по всем показателям, кроме одного: способности принимать прошлую инфекцию за настоящую в связи с высокой чувствительностью.
  • Погрешности методики, приводящие к ложным результатам, в основном завязаны на неправильный выбор биологических образцов, удаленных от места воспалительных изменений или загрязнением их посторонней инфекцией в процессе забора или транспортировки, нельзя полностью полагаться на диагностику крови. Для половых инфекций предпочтительнее исследовать соскобы урогенитального эпителия.
  • Еще одним аспектом становятся погрешности на этапе выполнения лабораторного этапа: старое оборудование, недостаточная квалификация персонала.
  • Поэтому всегда предпочтительнее выбирать для исследования клинику с репутацией. Оснащенную современным оборудованием и расходниками и совмещающую в себе консультативный прием специалистов и лабораторные мощности.

 Вариации ПЦР методики

Существуют различные модификации полимеразной цепной реакции, направленные на улучшение результативности.

    • Количественная проводится с использованием маркеров ДНК (зондов), которые в реальном времени позволяют подсчитать количество полученного в результате анализа продукта. Участки ДНК, исполняющие роль зонда, иногда заменяют флуоресцирующим красителем, который сильнее светится на меченых участках, удваивающихся ДНК.
    • Вариант молекулярных колоний задействует акриламидный гель, благодаря которому образуются молекулярные колонии в точках, где есть искомые ДНК.
    • Ступенчатая ПЦР позволяет избегать неспецифичного связывания фрагментов ДНК.
    • RAPD используют, когда исследуемый материал может содержать сходные геномы близкородственных организмов и их требуется различить.
    • Вложенная позволяет с помощью двух пар праймеров провести две реакции, удвоив не только первичную матрицу, но и продукты ее амплификации.

Выбор методик обусловлен в лабораториях и клиниках обычно не только диагностическими потребностями, но и существующими возможностями.

То есть наличием или отсутствием расходных материалов, используемых в различных модификациях исследований.

 Что означает ответ в бланке ПЦР

Отправляясь на обследование, проходя его или получая ответ анализа на руки, не нужно думать, что результат автоматически равняется диагнозу.

Целый ряд обстоятельств может сопровождать присутствие в организме инфекционного агента.

ПЦР определяет не только живой, но и погибший после медикаментозного лечения биологический материал.

Правильно расшифровать и истолковать данные анализов может только грамотный врач-клиницист.

Нельзя пренебрегать полноценной консультацией, лишь обратившись в лабораторию и выполнив исследование.

Каждое заболевание требует полноценного подхода: поиска его причины, разработки тактики лечения и достижения результатов.

Максимально коротким этот путь становится только при содействии врача.

Он в состоянии не только подобрать лечение, но и провести его коррекцию в случае необходимости, а также проконтролировать результаты и эффективность терапии.

Большой процент половых инфекций существует в скрытых, хронических формах или объединяется с другими представителями соей группы.

Хламидиям могут сопутствовать трихомонады и гонококки, гепатитам — ВИЧ и туберкулез, герпесу — папилломавирус.

Даже скудная симптоматика хронических инфекционных процессов или ее отсутствие – не гарантия латентного периода инфицирования или отсутствия позднейших осложнений.

Попытки отмахнуться от проблемы или сэкономить на ее решении часто оборачиваются не только лишними затратами времени и денежных средств.

Но и потерями репродуктивных возможностей и сексуального здоровья.

Рационально выбирая врача, а не только клинику и лабораторию, вы решаете задачу сохранения здоровья максимально эффективно.

При необходимости сдать ПЦР анализ обращайтесь к автору этой статьи – венерологу в Москве с многолетним опытом работы.

onvenerolog.ru

Инфекции, которые определяет пцр анализ. Их диагностика и расшифровка

В последние годы медицина и наука совместно прикладывают большое количество усилий для того, чтобы своевременно диагностировать инфекционные заболевания и начинать их лечение еще на ранних стадиях. Во многом помогает в этом метод полимеразной цепной реакции, которая также известна под сокращенным названием ПЦР.

Многие пациенты интересуются, в чем суть исследования, и какие инфекции с его помощью можно диагностировать. Какой биоматериал можно использовать, и как приготовиться к прохождению анализа?

Суть ПЦР-методики

Первоначально ПЦР разрабатывался, как методика научных исследований. Ее активно применяли в молекулярной биологии для исследования различных процессов, происходящих с живыми организмами.

Только спустя приличный промежуток времени реакцию цепной полимеризации стали применять в медицине, как полноценный способ диагностики. Сегодня с ее помощью можно не только выявить острое заболевание. Но и определить хронический процесс, диагностировать генетические патологии. И, что особенно важно, определить наличие инфекции еще до того, как у человека появятся ее первые симптомы. То есть ПЦР остается рабочим методом даже в том случае, если инфекция находится в периоде инкубации.

В основе лежат методы молекулярной биологии, так как анализ пришел именно из этой научной сферы. В биологический материал пациента добавляют специальные реагенты. Они вступают в реакции с ДНК или РНК возбудителя.

То, с чем реагент вступит в реакцию, зависит непосредственно от того, какой материал содержится в исследуемых жидкостях или тканях. После того, как реакция стартовала, начинается копирование выявленных частиц возбудителя. Проходит копирование в несколько этапов, чтобы процесс был более легким. Как только умножение выявленных патологических фрагментов подходит к концу, лаборант, следивший за ходом исследования, может сравнить полученные данные со специальной базой данных. Именно на этом этапе и опознается возбудитель, спровоцировавший патологические изменения в организме человека.

Список выявляемых инфекций

ПЦР инфекции, выявляемые с помощью исследования, очень многообразны. Список включает множество позиций. Причем есть возможность поставить диагноз не только бактериальной, но и вирусной или грибковой инфекции. В результате ценность ПЦР как способа диагностики только возрастает.

С помощью методики диагностируют следующие заболевания:

  • Вирус иммунодефицита человека

ПЦР исследование при подозрении на заражение человека ВИЧ-инфекцией является едва ли не золотым стандартом. С его помощью удается обнаружить в организме этот опасный вирус, который приводит к сильнейшим изменениям в иммунной системе.

Выявить герпес с помощью этого подхода можно не только в стадии обострения, но и во время ремиссии заболевания. Что гораздо важнее, как говорят врачи, появляется также возможность точно определить генотип патогена. А значит и подобрать правильное лечение.

  • Различные инфекции мочеполовых путей

В это группу входят гонорея, микоплазмоз, уреаплазмоз, хламидиоз, трихомониаз и др. Список весьма обширен и включает в себя около 30 возбудителей. ПЦР методика постепенно вытесняет более классические методы, такие как микроскопия и посев. Объясняется это тем, что классические способы диагностики требуют большого количества времени. А оно может быть по-настоящему важным в лечении.

ПЦР на гепатиты позволило сделать настоящий прорыв в лечении этих опасных не только для здоровья, но и для жизни заболеваний. Сейчас без полимеразной реакции нельзя представить себе не только правильное определение вида вируса. Но и назначение адекватной терапии пациентам, столкнувшимся с этими вирусными болезнями.

  • Вирус папилломы человека

ВПЧ - еще один распространенный вирус, который диагностируется с помощью цепной полимеризации. Причем часто важно не просто определить наличие вируса, но и установить, что это за штамм. Исследование играет роль для представительниц прекрасного пола. Дело в том, что многие женщины страдают от ВПЧ, некоторые штаммы которого могут способствовать формированию рака шейки матки. Только своевременная диагностика и принятие мер помогут в этом случае избежать беды.

  • Цитомегаловирус

Цитомегаловирусная инфекция, как и ВПЧ, распространена довольно широко. Наибольшую угрозу она представляет для беременных женщин. Так как способствует рождению ребенка с различными дефектами, иногда вплоть до летального исхода. На цитомегаловирус и антитела к нему проверяют многих беременных представительниц прекрасного пола.

Полимеразная цепная реакция в диагностике этой болезни играет не последнюю роль.

Особенно важно это, учитывая тот факт, что туберкулез очень распространен. Он тяжело поддается лечению и часто характеризуется весьма скудной симптоматикой.

ПЦР чаще всего используют для того, чтобы подтвердить итоговый диагноз, который уже был заподозрен из-за положительной пробы манту. Естественно, список инфекционных болезней, выявляемых с помощью полимеразной реакции, далеко не полный. Доктор может назначать обследование и при подозрении на другие ЗППП или инфекционное поражение иных органов и тканей.

Какой биоматериал может использоваться

Как отмечают доктора, для подтверждения диагноза могут применяться самые разные биологические материалы.

Наиболее часто применяют:

  • Сыворотку или плазму крови, или саму кровь. В них выявляются ВИЧ, цитомегаловирус, все гепатиты, передаваемые половым путем, герпес. Также кровь берется в том случае, если необходимо определить генетические заболевания.
  • Соскобы с различных слизистых оболочек. Их особенно часто рекомендуют выполнять, например, при подозрении на заболевания, передающиеся половым путем. Эффективны соскобы со слизистых, если патогенные микроорганизмы поражают именно слизистые оболочки в первую очередь.
     

  • Различные биологические жидкости. Пациенту мужского пола может потребоваться сдать на анализ секрет простаты или сперму. Если речь о женщине, то у нее для исследования могут браться околоплодные воды во время беременности. У пациента любого пола берутся слюна, смыв с бронхов, суставная смазка и жидкость, находящаяся в спинном мозге.
  • Мокрота. Ее забирают для оценки в том случае, если подозревается легочная форма некоторых бактериальных заболеваний. Также ее обязательно исследуют при подозрении на туберкулезное поражение.
  • Моча. Ее исследование рекомендуется при многих урогенитальных исследованиях. У представителей сильного пола оценка мочи нередко может выступать вместо взятия соскоба с поверхности уретры, так как эта процедура травматична и весьма неприятна.
  • Биоптаты. Используются довольно редко. Их рекомендуют брать из желудка или двенадцатиперстной кишки в том случае, если у пациента есть подозрение на заражение хеликобактером.

Особенности подготовки к исследованию

Чтобы ПЦР анализ на инфекции оказался эффективным и достоверным, к его сдаче необходимо правильно подготовиться. Также рекомендуется соблюдать ряд правил при сдаче биоматериала, чтобы избежать столкновения с недостоверными результатами. Кровь всегда сдается по стандартной схеме.

Пациенту доктор советует прийти в больницу в утреннее время, на голодный желудок. Полученную кровь, плазму или сыворотку стараются в ближайшее время отправить в лабораторию.

Накануне исследования рекомендуется отказаться от слишком острых, соленых или жареных блюд, не пить алкоголь. Также пациентам рекомендуется избегать воздействия на организм стрессовых факторов. Чтобы сдать мочу, подготовка в принципе аналогична.

Дополнительно пациенту рекомендуется приобрести в аптеке специальный стерильный контейнер и наполнить его в соответствии с инструкцией, полученной от доктора. Использовать банки и другие нестерильные емкости для сдачи анализа нельзя!

Если емкость заполняется в домашних условиях, доставить ее больницу нужно максимум в течение двух часов. При этом нельзя допускать остывания емкости.

Соскоб со слизистых сдается всегда в условиях больницы. При этом как мужчинам, так и женщинам рекомендуется минимум на сутки отказаться от секса и не мочиться за 2-3 часа до сдачи анализа.

Важно помнить, что врач всегда даст подробную инструкцию относительно того, как правильно собирать материал для исследования. Если получить инструкцию от доктора не удалось, его всегда можно спросить, каких рекомендаций стоит придерживаться, чтобы результаты были достоверными.

Особенности расшифровки

Расшифровка результатов может показаться совсем простым делом. Ведь существует только два варианта ответа: положительный и отрицательный. Если результат отрицательный, значит человек, сдававший биологический материал, не заражен той инфекцией, проверку на которую он проходил. Если же результат положительный, значит инфекция присутствует в организме. И нужно как можно скорее начать терапию, чтобы с ней справиться.

Как отмечают доктора, расшифровка только кажется легким делом.

На самом же деле ее выполнение - дело непростое. Потому что необходимо учитывать хоть маленький, но риск ложноположительных и ложноотрицательных реакций. Только доктор, оценив симптомы болезни у конкретного пациента, его общее состояние и другие параметры, может сказать, насколько можно доверять полученным результатам. Если они оцениваются, как сомнительные, больного с большой долей вероятности отправят сдавать анализы повторно.

Точность методики

Многих пациентов интересует вопрос о том, насколько сильно можно доверять исследованию. Как отмечают врачи, это один из самых высокоточных методов диагностики различных инфекций, которые существуют на сегодняшний день. Его точность объясняется тем, что работа происходит с ДНК и РНК. А эти элементы строго индивидуальны для каждого вида патогенных микроорганизмов. Следовательно, риск ошибки сведен к минимуму.

Опираясь на полимеразную реакцию цепного типа, можно узнать:

  • есть в организме патогенные элементы, или они отсутствуют;
  • определить, что конкретно за инфекция стала причиной появления тех или иных симптомов;
  • поставить диагноз даже в том случае, если микробов или вирусов еще очень мало, и другими методами диагностики они не улавливаются.

Важно помнить, что даже ПЦР не дает 100% надежности. Существует риск столкновения с неверными результатами. И только врачебная оценка может помочь точно понять, стоит ли человеку начинать лечение. 

Преимущества и недостатки

Как и любой другой метод, ПЦР обладает своими преимуществами и недостатками. Преимуществ, как отмечают доктора, на сегодняшний день больше.

Среди них:

  • высокая чувствительность тестовых систем, позволяющая ставить диагнозы даже в сложных случаях, когда возбудитель еще находится в периоде инкубации;
  • высокая специфичность тестов, позволяющая точно понять, что за патоген стал причиной негативных процессов;
     

  • универсальность методики, заключающаяся в том, что с помощью одного метода можно без проблем провести исследование на разные микроорганизмы, используя один и тот же биоматериал;
  • быстрота исполнения, позволяющая получить результаты максимум через сутки после проведения анализа, а иногда и значительно быстрее;
  • возможность обследоваться на заражение сразу несколькими инфекционными заболеваниями без необходимости сдавать множество разных биологических материалов.

Несмотря на большое количество преимуществ, недостатки у ПЦР-метода также имеются. Во-первых, требуется хорошее техническое оснащение лаборатории. Во-вторых, лаборант должен быть хорошо обучен и обладать специфическими знаниями, чтобы не допустить ошибок в технологии. Если два этих условия соблюдаются, реакция цепной полимеризации становится эффективным способом постановки диагнозов!

www.venerologia.ru

что это, на какие инфекции сдают и как подготовиться.

Кровь методом ПЦР чаще всего проверяют на вирусные инфекции.

Значительно реже там определяются бактерии: стафилококки, стрептококки, туберкулезные палочки.

Анализ крови методом ПЦР позволяет установить, есть ли инфекция в организме.

Тест очень чувствительный.

Он выявляет инфекционные заболевания на ранней стадии, когда антитела к возбудителям ещё не образуются.

Основные болезни, которые выявляют в крови:

  • ВИЧ
  • гепатиты В и С
  • различные типы герпеса (возбудители генитального, лабиального герпеса, опоясывающего лишая, цитомегаловируса и инфекционного мононуклеоза)

При необходимости возможна количественная молекулярная диагностика методом ПЦР кровь.

Она позволяет понять, требуется ли пациенту лечение, какие нужны дозы и длительность курса терапии, приносят ли результат проводимые терапевтические мероприятия.

ПЦР крови на инфекции используется для лабораторного контроля их излеченности.

Рассмотрим основные заболевания, при которых используется исследование крови ПЦР.

Анализ крови методом ПЦР на туберкулез

ПЦР – один из методов диагностики туберкулеза.

С помощью лабораторного теста возможно выявление любых форм заболевания.

В том числе ранних, некультивируемых, с нетипичной локализацией возбудителя.

Методика имеет более высокую чувствительность, чем бактериологическое исследование.

Она очень информативна, так как позволяет проводить дифференциальную диагностику, отличая туберкулезные и нетуберкулезные микобактерии.

ПЦР обеспечивает их видовую и штаммовую идентификацию.

Особую ценность методика имеет при выявлении внелегочных форм туберкулеза.

Благодаря определению вида микобактерий, она дает возможность подобрать эффективную терапию.

Использование ПЦР для диагностики туберкулеза рекомендовано Министерством здравоохранения РФ, приказом №64 от 21 февраля 2000 года.

Для диагностики туберкулеза может использоваться любой биоматериал.

Это мокрота, кровь, пунктат лимфоузла, моча и т.д.

Кровь из вены для ПЦР сдают для дифференциальной диагностики ограниченных и диссеминированных форм туберкулеза.

Проще говоря, метод позволяет понять, находятся бактерии в ограниченном очаге, или уже проникли в кровь и разносятся по всему организму.

Часто ПЦР крови на микобактерии применяют у детей.

В том числе при отрицательных результатах бактериологического исследования.

Тем не менее, ПЦР крови имеет не очень высокую чувствительность.

Поэтому в клинической практике используется нечасто.

Наибольшая вероятность обнаружения ДНК в крови – у пациентов с ВИЧ или на фоне приема иммуносупрессивных препаратов.

У многих ПЦР дает отрицательные результаты даже в случае диссеминированных форм.

У женщин ДНК микобактерий определяют в менструальной крови.

Исследование проводится для диагностики туберкулеза половых органов.

Анализ делают на такие виды бактерий:

  • tuberculosis
  • bovis
  • bovis BCG
  • microti
  • africanum

ПЦР крови на герпес

Для диагностики герпетической инфекции ПЦР крови применяется нечасто.

Обычно берут материал с поверхности высыпаний.

Но иногда их нет.

В таком случае исследование крови остаётся информативным методом диагностики заболевания.

Показания к проведению теста:

  • ультразвуковые признаки внутриутробной инфекции
  • фетоплацентарная недостаточность
  • обследование детей, родившихся от женщин-носителей герпеса
  • увеличение печени, длительная лихорадка на фоне беременности
  • иммунодефицитные состояния и ВИЧ
  • подозрение на осложнения герпеса

Однажды заразившись, человек навсегда становится носителем герпеса.

Но ДНК определяется в крови только в активную фазу инфекции.

При бессимптомном течении ПЦР дает отрицательные результаты.

Анализ крови на ВИЧ методом ПЦР

ПЦР – в большей мере уточняющий метод при ВИЧ, нежели подтверждающий.

Для первичной диагностики обычно применяются серологические исследования.

В крови выявляют антитела и антигены к ВИЧ.

Иногда ПЦР применяют для установления диагноза.

Области применения метода:

  1. Тестирование донорской крови.

Вполне вероятно, что она была сдана человеком в период, когда антитела ещё не образовались.

Поэтому выявление РНК может дать положительные результаты при отрицательных серологических исследованиях.

  1. Диагностика новорожденных.

Если ребенок родился от матери, страдающей ВИЧ, его всегда обследуют.

В том числе если была проведена необходимая профилактика.

Но выявлять вирус серологическими методами нецелесообразно.

Потому что ребенок первых лет жизни содержит в крови материнские антитела.

Соответственно, они обязательно будут определены в ходе анализа, и не важно, болен ребенок или нет.

Серологические тесты всегда дадут положительный результат.

В такой ситуации на помощь приходит ПЦР.

Если РНК отсутствует, то ребёнок здоров.

  1. Подозрение на острую ВИЧ инфекцию в ранний период после заражения.

На антитела кровь сдают только через 3 месяца после заражения.

Есть есть необходимость ранней диагностики, используют только ПЦР.

Такая необходимость возникает, если есть основания полагать, что человек инфицирован.

По симптомам этого обычно понять нельзя.

Потому что клинические проявления ВИЧ не специфичны: они такие же, как у множества респираторных вирусных инфекций.

Но бывает так, что симптомы появляются на фоне данных анамнеза, указывающих на высокий риск инфицирования.

Например, медицинский работник имел контакт с кровью ВИЧ-инфицированного.

Если через несколько недель у него появились симптомы инфекции, это повод для обследования крови на РНК ретровируса методом ПЦР.

  1. Уточнение спорных результатов серологического исследования.

ПЦР может применяться только вместе с анализом крови на антитела, но не вместо него.

Проблема этого исследования состоит в том, что оно может дать ложноотрицательные результаты, пусть и в небольшом количестве случаев.

Причины их следующие:

  • в большинстве случаев ПЦР делают только на ВИЧ 1 типа, но около 0,5% случаев болезни вызывает ВИЧ 2 типа
  • не выявляются мутантные штаммы вируса, в то время как антитела к ним образуются и могут быть выявлены в крови
  • около 1% людей способны силами собственного иммунитета сдерживать репликацию вируса, у них есть в крови антитела, но не определяется РНК

При этом ПЦР играет важнейшую роль в лечебном процессе.

Методика позволяет оценить вирусную нагрузку.

Она позволяет врачу понять, когда стоит назначать лечение, эффективно ли оно или нужно менять схему.

На фоне удачной терапии ПЦР крови на ВИЧ становится отрицательной.

При этом антитела по-прежнему сохраняются и могут выявляться в анализах.

Поэтому серологические методы малоинформативны в оценке эффективности терапии и не используются с этой целью.

Анализ крови на стафилококковую и стрептококковую инфекцию методом ПЦР

Исследование крови на бактерии методом ПЦР проводят при тяжелых инфекциях:

  • пневмониях
  • менингитах
  • сепсисе

Этиологическая диагностика позволяет врачу не только подтвердить бактериальную этиологию процесса.

Она дает возможность подобрать наиболее эффективные препараты для лечения.

Потому что при разных патологиях назначаются разные антибиотики.

Если стрептококковая инфекция чувствительна к большинству препаратов, в том числе бета-лактамным антибиотикам, то стафилококк часто резистентный ко многим лекарственным средствам.

ПЦР обычно делают качественную.

Оценивается факт присутствия бактерий в крови, а не их количество.

Анализ крови на паразитов методом ПЦР

В крови определяют ДНК листерий и токсоплазм.

Это одноклеточные паразиты.

Листериозом чаще всего заражаются через еду.

Болезнь может давать осложнения, вызывать воспаление структур центральной нервной системы.

В группе риска – беременные, пожилые, лица с иммунодефицитом или онкозаболеваниями.

В большинстве же случаев листериоз протекает как кишечная инфекция.

Септическая его форма очень опасна и часто приводит к летальному исходу.

Токсоплазма – распространенная, не столь опасная инфекция.

Она представляет наибольшую угрозу для беременных.

Анализ назначается при:

  • привычном невынашивании беременности
  • длительной лихорадке неясного происхождения
  • ВИЧ
  • увеличении печени и селезенки

Все беременные сдают анализ на токсоплазму.

Хотя обследуют их обычно при помощи серологических методов.

Болезнь часто манифестирует на фоне иммунодефицита.

Анализ крови на ПЦР гепатит С количественный

ПЦР применяется с целью подтверждения диагноза.

При появлении клинических признаков или наличии анамнестических данных, указывающих на высокую вероятность этого заболевания, доктор назначает определение в крови РНК вируса.

Исследование очень чувствительно.

Поэтому может выявлять гепатит С в бессимптомной стадии.

Показания к назначению:

  • выявление в крови HCV Ab
  • негативные результаты HCV Ab на фоне иммунодефицита при имеющихся признаках поражения печени
  • начало лечения гепатита С при подтвержденном диагнозе

Количественная ПЦР проводится при:

  • принятии решения о необходимости противовирусной терапии
  • перед началом противовирусного лечения, для определения исходной вирусной нагрузки
  • в процессе лечения, для отслеживания эффективности проводимой терапии
  • в конце курса, для подтверждения излеченности или определения показаний для повторной терапии

До начала лечения ПЦР делают всем пациентам.

Знать исходную вирусную нагрузку врачу необходимо, чтобы:

  • определиться с дозами препаратов, длительностью лечения
  • оценить ожидаемую эффективность
  • в ходе дальнейших количественных исследований сравнить новые результаты с предыдущими, чтобы понять, есть ли положительная динамика

Раньше для первичной диагностики заболевания применялись качественные тесты.

Дополнительно использовались количественные, которые делали перед началом лечения и в процессе проведения терапии.

Но сегодня количественная ПЦР имеет столь же высокую чувствительность, что и качественная.

Она позволяет определять вирус гепатита С в крови с нижним порогом чувствительности 10-15 МЕ/мл.

Благодаря внедрению ПЦР в разы уменьшилось количество биопсий печени, проводимых с диагностической целью.

Методика позволяет врачу наблюдать за течением заболевания и эффективностью терапии.

Оценивать вирусологическую нагрузку в динамике ВОЗ рекомендует одним и тем же выбранным методом.

Как правило, врач направляет одного пациента в одну и ту же лабораторию для проведения одного и того же теста.

Такой подход обеспечивает точность результата.

В том числе при определении устойчивого вирусологического ответа, свидетельствующего об эффективности проводимой терапии.

Анализ крови ПЦР на гепатит В количественный

ПЦР позволяет выявить ДНК вируса гепатита В в различном биоматериале:

  • крови
  • лимфоцитах
  • биоптате печени

В рутинной практике используется анализ крови ПЦР на гепатит В.

Этот метод обладает самой высокой чувствительностью.

Иногда он незаменим в первичной диагностике.

Для установления диагноза гепатита В достаточно определения в крови антигенов и антител.

Но иногда инфекция протекает в скрытой форме.

Традиционно проводимые для установления первичного диагноза исследования могут давать отрицательные результаты.

При этом с помощью ПЦР удается выявить вирус.

Кроме того, ДНК возбудителя гепатита В является самым ранним маркером этого заболевания.

Она начинает определяться в крови раньше, чем антитела и антигены.

Благодаря ПЦР можно выявить форму заболевания, вызванную мутантными штаммами вируса.

Определение ДНК позволяет не только констатировать инфекцию.

Метод также дает возможность определять репликативную активность HBV.

ПЦР становится положительной ещё в инкубационный период.

В острый период заболевания количественные показатели увеличиваются.

ПЦР становится негативной уже в период ранней реконвалесценции.

Это позволяет врачу подтвердить излеченность с помощью данного метода.

Таким образом, области применения этого исследования следующие:

  • первичная диагностика заболевания в раннем периоде после заражения
  • проверка донорской крови
  • выявление форм заболевания, которые не обнаруживаются при помощи анализа крови на антигены и антитела к вирусу гепатита В (субклинические формы, мутантные штаммы вируса)
  • принятие решение о необходимости назначения терапии (вирусологическая нагрузка)
  • определение тактики лечения
  • оценка его эффективности

Анализ могут назначить пациентам, которые ранее переболели вирусным гепатитом В, а сейчас получают иммуносупрессивную терапию.

Потому что это фактор риска повторного возникновения заболевания.

Расшифровка результатов:

  • положительная ПЦР при любом количественном результате – устанавливается диагноз гепатита В
  • уровень ДНК больше 10 в 5 степени копий ДНК в мл – требуется лечение
  • уровень ДНК меньше 10 в 3 степени – лечение было эффективным, болезнь перешла в стадию ремиссии, прогноз благоприятный (хотя возможна реинфекция)

Если анализ отрицательный, это говорит о том, что человек здоров и не встречался с вирусом, либо излечен от гепатита В.

В результате успешной терапии ДНК полностью исчезает из крови и не определяется в ней при помощи ПЦР.

ПЦР на герпес зостер

Вирус варицелла зостер является возбудителем ветрянки и опоясывающего лишая.

Его ДНК появляется в крови только в острую фазу инфекции.

Ветрянка обычно диагностируется клиническим методом.

Потому что она имеет достаточно характерные симптомы.

В то время как при опоясывающем герпесе происхождение болезни не всегда очевидно.

Высыпания появляются не сразу.

А если появляются, то клиника может быть атипичной.

Для подтверждения диагноза может быть использована диагностика крови методом ПЦР.

Такая диагностика применяется нечасто.

Но иногда в ней возникает необходимость в спорных клинических ситуациях.

Где сдать кровь ПЦР?

Если вам нужно сдать анализ крови методом ПЦР, приходите в нашу клинику.

Здесь работают опытные врачи-венерологи.

Мы специализируемся в первую очередь на диагностике и лечении заболеваний с половым путем передачи.

У нас можно сдать кровь на:

  • ВИЧ
  • различные виды герпеса
  • вирусные гепатиты В и С

При необходимости мы также можем обследовать вас на туберкулез, стафилококк и многие другие инфекции.

К нам стоит обращаться в таких ситуациях:

  • планирование беременности
  • 1 триместр беременности (профилактическое обследование)
  • контакт (половой или любой другой) с источником инфекции – ВИЧ, гепатита и других опасных заболеваний
  • появление подозрительных симптомов, указывающих на возможное заражение вирусными инфекциями (пузыри на коже, увеличение печени и селезенки, очень тяжелые гриппоподобные симптомы)
  • положительный анализ других исследований (антитела, антигены)
  • рождение детей от инфицированных матерей

Мы также обследуем пациентов с уже установленным диагнозом.

Это необходимо для контроля лечения.

Наши преимущества:

  • работаем с лучшими лабораториями Москвы
  • мы сотрудничаем сразу с несколькими лабораториями, поэтому предлагаем широчайший спектр различных анализов, в том числе тех, которые используются редко, например, для выявления генерализованных форм инфекций
  • идеальное соблюдение правил забора биоматериала позволяет обеспечить точные результаты;
  • возможность анонимного обследования
  • доступные цены
  • аккуратный, безболезненный забор крови из вены без боли, ран, синяков и воспалений

После диагностики в нашей клинике можно пройти лечение, если в нём возникнет необходимость.

Для сдачи анализов крови методом ПЦР обращайтесь к автору этой статьи – венерологу в Москве с многолетним опытом работы.

intimnyjotvet.ru

Иммуно-ПЦР — Википедия

Общая схема иммуно-ПЦР

Иммуно-ПЦР[1] (англ. immuno-PCR) — сверхчувствительный метод выявления антигенов, основанный на их специфичном взаимодействии с антителами и выявлении этого взаимодействия при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Во многом метод иммуно-ПЦР схож с иммуноферментным анализом (ИФА), однако вместо фермента для выявления комплекса антиген-антитело в нём используется фрагмент ДНК, количество которого экспоненциально увеличивается в ходе ПЦР. Именно амплификация этого фрагмента ДНК в реакционной смеси и является аналитическим сигналом метода[2].

Метод иммуно-ПЦР был предложен в 1992 году. Тогда учёные из Калифорнийского университета использовали его для обнаружения бычьего сывороточного альбумина (БСА). В их эксперименте предел обнаружения на пять порядков превзошёл предел обнаружения стандартного ИФА и составил 580 молекул на образец[2][3].

Метод иммуно-ПЦР является комбинацией ИФА и ПЦР. Первый из них используется в том случае, если в клинической диагностике необходимо обнаружить гормоны, антитела, белки или токсины. Благодаря доступности антител различной специфичности этот метод позволяет обнаруживать широкий диапазон антигенов. Однако чувствительность ИФА сравнительно невысока. С другой стороны, широко применяемый метод ПЦР служит для обнаружения очень малых количеств ДНК. Теоретически даже одной копии обнаруживаемой ДНК в исследуемом образце достаточно, чтобы диагностировать вирусные и бактериальные заболевания либо наследственные болезни. Идея иммуно-ПЦР заключается в том, чтобы по-прежнему обнаруживать разнообразные антигены специфичными антителами, но положительный сигнал об этом обнаружении получать не при помощи фермента, как в ИФА, а при помощи ДНК-метки, как в ПЦР[4].

Реакция антитела с антигеном[править | править код]

На первой стадии иммуно-ПЦР проводят иммунохимическую реакцию между анализируемым соединением в образце и антителом. По аналогии с ИФА её реализуют в различных вариантах. В прямом варианте (рис. 1, А) образец, содержащий определяемый антиген, наносят на поверхность планшета, а затем антиген определяют непосредственно специфичным антителом, меченным ДНК. Если специфичное антитело с ДНК-меткой недоступно, то его определяют вторичным (антивидовым) антителом, связанным с ДНК. Такой формат называется непрямым (рис. 1, Б). Для определения антигена в матрицах (сыворотка крови, плазма) используют «сэндвич» (рис. 1, В). Для этого на поверхности планшета предварительно иммобилизуют связывающие антитела, которые связывают антиген при нанесении образца в лунку. Возможен также и непрямой вариант сэндвича (рис. 2, Г)[5][6].

Рис. 1. Форматы анализа: А — прямой; Б — непрямой; В — прямой сэндвич; Г — непрямой сэндвич

Для определения низкомолекулярных веществ используют конкурентный формат. В этом случае детектирующее меченое антитело взаимодействует не только с антигеном в анализируемом образце, но и с антигеном, иммобилизованном на твёрдой фазе. Чем больше антигена в образце, тем больше комплексов антиген — антитело образуется в растворе. Следовательно, меньше антител связывается с твёрдой фазой, и анализ даёт более низкий сигнал[5].

В некоторых случаях для детекции антигенов можно использовать не антитела, а аптамеры. Например, РНК-аптамер R18 специфично связывается с кроличьим IgG. Такая модификация называется иммуно-аптамерной ПЦР[7].

Амплификация ДНК-метки[править | править код]

На второй стадии, когда антиген связан с конъюгатом антитела и ДНК-метки, проводят полимеразную цепную реакцию, в результате которой количество ДНК в смеси экспоненциально возрастает. В первых экспериментах продукты амплификации анализировали электрофорезом в агарозном геле, однако для этого приходилось переносить реакционные смеси в гель, а результаты получались качественными или полуколичественными. В качестве альтернативы электрофорезу была предложена ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ): этот метод позволяет установить не только наличие ДНК-метки, но и её количество. При проведении ПЦР-РВ в смесь добавляют интеркалирующий краситель (например, SYBR Green I) или зонд TaqMan — и количество ДНК определяют по интенсивности флуоресценции. Проводить стадию амплификации можно как в той же пробирке, что и иммунохимическую реакцию, а можно переносить ДНК-метку в другую пробирку. Во втором случае её нужно предварительно отщепить при помощи рестриктаз или нагреванием до 95—100 °С. При этом отмечается, что анализ в одной пробирке существенно менее чувствителен[7][8].

Теоретически для получения положительного сигнала достаточно, чтобы в реакционной смеси оказалась одна копия ДНК-метки. В действительности чувствительность метода снижается за счёт стадий, основанных на взаимодействии антигена с антителом. Полагают, что предел обнаружения иммунохимических методов в целом составляет около 1000 молекул аналита в 100 мкл смеси. Методики иммуно-ПЦР, описанные во многих публикациях, показывают чувствительность, близкую к этому пределу обнаружения и даже ниже. Если принять, что типичный белок весит 50—100 кДа, то пересчёт предела обнаружения иммуно-ПЦР даст массу порядка пикограмма аналита. Этой чувствительности достаточно для обнаружения многих биомаркеров, присутствующих в организме в низкой концентрации[9].

Планшет для ПЦР

Платформой для анализа, как и в случае ИФА или ПЦР, служит 96-луночный микротитрационный планшет, который должен обладать способностью связывать антигены и быть термоустойчивым, чтобы ПЦР можно было провести прямо в нём, не перенося реакционную смесь в другой планшет. Также распространены поликарбонатные 8-луночные стрипы TopYield с повышенной связывающей способностью, разработанные специально для иммуно-ПЦР. (Хотя и существуют недостатки, связанные с формой их лунок: неравномерное распределение тепла при проведении ПЦР и возникновение зон преломления и отражения света, что затрудняет анализ кривых ПЦР.) Также иммуно-ПЦР проводят в поликарбонатных планшетах Corning Costar 6511 и Greiner Thermoquick polycarbonate plate 651570, а также в планшетах Robostrips[10].

Антитело, меченное фрагментом ДНК, является ключевым элементом в проведении иммуно-ПЦР. От строения этого конъюгата зависит чувствительность и воспроизводимость метода. По характеру связи между антителом и ДНК выделяют три основных типа таких конъюгатов: химерные белки, биотин-стрептавидиновые конъюгаты и ковалентные конъюгаты[11].

Химерный белок[править | править код]

Первоначально в иммуно-ПЦР использовали особый химерный белок, включавший в себя фрагмент белка А и фрагмент стрептавидина. Фрагмент белка А связывал антитело, а стрептавидин связывал ДНК, имеющую биотиновую модификацию (рис. 2, А). Такой конъюгат имеет два недостатка. Во-первых, синтез химерных белков сам по себе является трудоёмким. Во-вторых, белок А не только имеет сродство к указанному антителу, но и неспецифически взаимодействует со связывающими антителами, которые применяются при постановке иммуно-ПЦР в формате «сэндвича». Из-за этого возникает фоновый сигнал и снижается чувствительность метода[2][4].

Рис. 2. Конъюгаты антитела и ДНК: А — с использованием химерного белка; Б — на основе биотин-стрептавидинового взаимодействия; В — ковалентный конъюгат

Биотин-стрептавидиновые конъюгаты[править | править код]

Более простым на практике оказалось создание конъюгата на основе взаимодействия биотина и стрептавидина (рис. 2, Б)[12]. Известно, что тетрамерные белки авидин (природный) и стрептавидин (генноинженерный из культуры Streptomyces avidii) образуют очень устойчивый комплекс с биотином (константа диссоциации 10−13−10−15). В конъюгируемые молекулы — антитело и ДНК — химически вводят биотин, а затем эти молекулы смешивают со стрептавидином (он является более предпочтительным, поскольку, в отличие от авидина, не содержит углеводных фрагментов, приводящих к неспецифическим взаимодействиям) для образования конъюгата[2][13].

Такой подход не совсем оптимален, поскольку из-за четырёхвалентности авидина или стрептавидина получаемые конъюгаты могут иметь непостоянный состав, что отразится на воспроизводимости эксперимента[14]. Однако более поздние исследования самосборки подобных комплексов показали, что стрептавидин несмотря на свою четырёхвалентность склонен присоединять преимущественно две биотинилированные молекулы ДНК, а конъюгаты с четырьмя ДНК вообще не образуются[15]. Коммерческая доступность необходимых реагентов превратила этот подход в «универсальный протокол иммуно-ПЦР»[16], который приобрёл большую популярность[17].

Ковалентные конъюгаты[править | править код]

Благодаря развитию методов биоконъюгации стало возможным синтезировать ковалентные конъюгаты антител с ДНК химически, при помощи бифункциональных кросслинкеров (рис. 2, В). На рынке доступны многочисленные реагенты для этой цели. Как правило, конъюгация осуществляется путём химической модификации аминогрупп или тиольных групп ДНК или антитела. Разрабатываются также подходы, связанные с реакциями клик-химии. С другой стороны, в научной литературе представлены недостаточные или противоречивые данные о выходе таких конъюгатов и о методах их очистки[2][18].

Поскольку в ковалентных конъюгатах детектирующее антитело и ДНК-метка связаны однозначно (тогда как в биотин-стрептавидиновых конъюгатах это равновесные комплексы), это даёт возможность определять несколько антигенов в одном образце. Один из первых таких анализов был проведён для трёх аналитов с использованием ДНК-меток разной длины[19]. При определении интерлейкина 6 проводилось сравнение разных подходов и было показано, что использование ковалентных конъюгатов приводит к 100-кратному повышению чувствительности по сравнению с постадийным протоколом[20].

Лигирование сближенных проб

Основные этапы развития иммуно-ПЦР:[21]

  • 1992 — создание иммуно-ПЦР;
  • 1993 — создана первая коммерческая система;
  • 1995 — впервые использован ковалентный конъюгат антитела и ДНК;
  • 2000 — электрофорез заменён ПЦР в реальном времени;
  • 2005 — модификация иммуно-ПЦР с использованием «головастиков»;
  • 2006 — модификация иммуно-ПЦР с использованием фагового дисплея;
  • 2007 — модификация иммуно-ПЦР с использованием магнитных частиц;
  • 2009 — модификация иммуно-ПЦР с использованием золотых наночастиц;
  • 2010 — конъюгаты на основе замка Tus—Ter.

Повысить чувствительность иммуно-ПЦР удалось при помощи «двойного узнавания» антигена. Метод лигирования сближенных проб основан на использовании двух антител, специфичных к двум соседним эпитопам определяемого антигена. ДНК-метки этих антител отличаются нуклеотидной последовательностью, но имеют небольшие комплементарные участки. Когда оба антитела взаимодействуют с антигеном, их ДНК-метки сближаются в пространстве и затем соединяются под действием фермента лигазы. Так возникает новая ДНК-цепь, которая и подвергается амплификации. Поскольку положительный сигнал возможен только при узнавании антигена сразу двумя антителами, такая схема позволяет исключить неспецифическое связывание[22].

Возможности иммуно-ПЦР расширяются благодаря использованию в анализе различных наноструктур. Так, например, в качестве носителя антител предложено использовать магнитные или золотые наночастицы. Их использование позволяет легче проводить необходимые манипуляции и снижает влияние посторонних компонентов образца. В методе биобаркодинга (англ. biobarcode assay) используются и те, и другие наночастицы: на магнитных находятся связывающие антитела, а на золотых — детектирующие антитела и ДНК-метка. Анализ проводится в формате сэндвича, после чего иммунокомплексы собирают магнитом, а ДНК-отщепляют от золотых наночастиц для дальнейшего анализа. Название «биобаркодинг» связано с тем, что в оригинальной публикации предлагался сканометрический метод анализа. Так, отщеплённую ДНК конъюгировали на стеклянную поверхность, на которой предварительно были закреплены олигонуклеотиды, комплементарные половине цепи ДНК. Затем вносили золотые наночастицы, покрытые серебром(I) и содержащие олигонуклеотиды, комплементарные второй половине ДНК-метки. Затем серебро восстанавливали. При наличии в системе ДНК-метки («штрихкода») система давала положительный сигнал. Перспективы этого метода связаны с возможностью одновременного определения нескольких аналитов, поскольку наночастицы можно «кодировать» олигонуклеотидами с уникальной последовательностью олигонуклеотидов[23][24].

Интересным развитием метода является использование так называемых «головастиков» (англ. tadpoles). Это особые конъюгаты, в которых белковая «голова» присоединена к ДНК-хвосту. В белковой части таких конъюгатов находится гистидиновый таг, распознающий целевой антиген, интеин и хитин-связывающий домен. Белок очищали на хитин-содержащих колонках и в иммобилизованном состоянии вырезали интеин и присоединяли к нему олигонуклеотид, содержащий остаток цистеина[25][26].

Существуют также системы для иммуно-ПЦР с использованием вирусных частиц, липосом и фагового дисплея[27].

В 2010 году было предложено использовать конъюгаты на основе замка Tus—Ter (англ. Tus–Ter lock). Tus — это белок, останавливающий процесс репликации; он прочно связывается с короткими нуклеотидными последовательностями Ter. Комплекс Tus—Ter использовали для стехиометрического и сайт-специфического соединения ДНК-метки и антитела[28].

По данным на 2015 год, метод иммуно-ПЦР коммерциализирован: услуги по созданию аналитических систем, в том числе соответствующие стандартам GLP, оказывают контрактные исследовательские организации и биоаналитические сервисы[29].

Различные исследовательские группы применили метод иммуно-ПЦР для обнаружения важных белков и низкомолекулярных соединений. Одновременно многие из этих экспериментов были использованы для изучения возможностей самого метода, сравнения различных форматов и типов конъюгатов, определения пределов чувствительности. Данные по этим исследованиям систематизированы в обзорах[30][31], а ниже приведены основные результаты по классам обнаруживаемых аналитов.

Белки опухолей[править | править код]

Самыми распространёнными антигенами для иммуно-ПЦР являются маркерные белки, имеющие отношение к опухолям и присутствующие на ранних стадиях их развития в очень низкой концентрации. Наиболее важны среди них раково-эмбриональный антиген (РЭА) и простатический специфический антиген (ПСА). В одном из исследований метод иммуно-ПЦР оказался примерно в 1000 раз более чувствительным к РЭА, чем ИФА[32], а позже чувствительность к РЭА была доведена до 13 фг/мл, что в 1500 раз превышает чувствительность клинических методов[33].

ПСА послужил аналитом для испытания трёх форматов иммуно-ПЦР, из которых наиболее чувствительным оказался формат с использованием ковалентного конъюгата антитела и ДНК (предел обнаружения составил 48·105 молекул)[34]. Система на основе магнитных наночастиц позволила определить 0,1 пМ ПСА, что в 1000 раз чувствительнее, чем ИФА[35].

Белки вирусов[править | править код]

Иммуно-ПЦР применяют для определения вирусных белков, поскольку на ранних стадиях в организме присутствует очень малое число вирионов, и определить их можно только высокочувствительными методами. Одним из популярных антигенов этого типа является маркер вируса гепатита B HBsAg: работа нескольких групп позволила снизить предел обнаружения этого антигена методом иммуно-ПЦР до 15 фг на реакцию, а преимущество в чувствительности перед ИФА составило 2000 раз[36]. Кроме того, иммуно-ПЦР позволяет детектировать 10 нг HBcAg — другого белка, связанного с наличием в организме вируса гепатита B[37].

Антиген p24 является компонентом капсида вируса ВИЧ-1 и помогает выявить этот вирус на ранних стадиях. При помощи иммуно-ПЦР в разных опытах удалось обнаружить 1000 и 4600 молекул этого антигена[38]. Вирус Хантаан обычно обнаруживают методами иммуноанализа по нуклеокапсидному белку. Иммуно-ПЦР с использованием фагового дисплея позволила детектировать 10 пг/мл этого белка, а при использовании золотых наночастиц чувствительность повысилась до 10 фг/мл, что на семь порядков лучше, чем в случае ИФА[39]. В анализах на вирус птичьего гриппа H5N1 иммуно-ПЦР также превосходит ИФА и ПЦР в реальном времени в 1000 и 100 раз соответственно[40][41].

Также при помощи иммуно-ПЦР определяют аденовирусы, причём этот метод имеет преимущество перед ПЦР, поскольку для ПЦР необходимо выделить ДНК из образца, а в методе иммуно-ПЦР очистка от посторонних компонентов происходит на стадиях промывок. Чувствительность иммуно-ПЦР к ротавирусам, согласно литературным данным, совпадает с чувствительностью ПЦР. Также метод иммуно-ПЦР полезен для определения норовирусов[42].

Бактерии и токсины[править | править код]

Иммуно-ПЦР также используется для выявления патогенных микроорганизмов. Так, например, золотистый стафилококк можно определить по его многим ферментам, белкам и токсинам, прежде всего по белку А и энтеротоксину типа B. Первый из них удалось определить методом иммуно-ПЦР в концентрации 1·10−17 г/мл, а для второго были разработаны системы, позволяющие определять его как в чистых культурах, так и в образцах пищи[43][44]. Описан метод детектирования бактерии Borrelia burgdorferi — возбудителя болезни Лайма — по специфическим антителам IgG и IgM против этой бактерии[45][46].

Описаны также примеры определения бактериальных, растительных и микотоксинов. Например, ботулотоксин в деионизованной воде удалось определить в концентрации около 12 молекул/мл (0,02 фг/мл). В другом эксперименте анатоксин А определили при концентрации 90 пг/мл. Также токсины определяли в молоке (3,75 пг/мл для ботулинического токсина типа А, 750 пг/мл для ботулинического анатоксина типа В, 0,1 пг/мл для шига-токсина типа 2). Рицин в пищевых продуктах обнаруживали при концентрации 10-100 пг/мл. Опубликованы также данные по определению афлатоксина и полихлорированных бифенилов[47].

Метаболические белки и белки иммунной системы[править | править код]

Диагностика некоторых болезней и нарушений основана на обнаружении не внешних антигенов, а компонентов самого организма, например ферментов, низкомолекулярных соединений и ионов. В некоторых случаях для этих целей применим метод иммуно-ПЦР. Так, фактор некроза опухоли удалось обнаружить в концентрации до 1 фг/мл (в 50 тыс. раз чувствительнее, чем ИФА). Щелочную фосфатазу детектировали специфичным антителом IgG в количестве 10−11 U[48].

Некоторые антигены связаны с развитием генетических нарушений и болезней нервной системы. Высокая чувствительность иммуно-ПЦР позволяет определять очень низкие концентрации прионов в трудных для получения образцах тканей мозга и спинномозговой жидкости. Предложена методика, дающая возможность определить методом иммуно-ПЦР одновременно три основных белка, связанных с нервной системой: приона, нейрон-специфической енолазы и глиального фибриллярного кислого белка[48].

Важными маркерами нарушений нервной системы являются тау-белки: дефектные тау-белки (фосфорилированные по эпитопам либо изоформы этих белков) плохо стабилизируют микротрубочки, из-за чего возникают патологии. Иммуно-ПЦР позволяет определять дефектные изоформы тау-белков в концентрации 2-10 пг/мл. Бета-амилоид, один из инициаторов болезни Альцгеймера, удалось детектировать в концентрации 2 амоль/л[48].

Болезнь Фабри связана с дефектами в гене альфа-галактозидазы A. Обычно этот белок определяют методом ИФА, но иммуно-ПЦР даёт 25-кратное увеличение чувствительности[49].

Метод иммуно-ПЦР является очень чувствительным, поэтому критическую роль в нём играет фоновый сигнал, который может мешать наблюдению положительного результата. Причиной этого является неспецифическое связывание компонентов реакционной смеси или наличие следов свободной ДНК в конъюгате антитела с ДНК. Единичные ДНК оказываются даже в образцах отрицательного контроля, и практически всегда на 30—40 цикле ПЦР проявляется их наличие. Оптимизация иммуно-ПЦР (подбор отмывочных растворов, увеличение продолжительности отмывки, использование нуклеаз) позволяет достичь максимальной разницы между фоновым сигналом и сигналом в пробирках с наличием определяемого антигена. Чувствительность иммуно-ПЦР имеет ещё одну обратную сторону: качество определения ухудшается из-за возможности перекрёстного загрязнения реакционных смесей или попадания примесей из окружающей среды. Чтобы избежать этого, место иммунохимической работы и место проведения ПЦР разделяют в пространстве[50][51].

Иммуно-ПЦР является трудоёмким методом: проведение анализа предусматривает около 20 стадий промывки, а суммарно анализ длится от 26 часов до 2 дней. Время анализа можно сократить за счёт предварительного приготовления конъюгатов антитела с ДНК. В противном случае их необходимо готовить в ходе анализа; при этом число стадий инкубации и промывки увеличивается[52].

  1. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 377.
  2. 1 2 3 4 5 Chang et al., 2016, p. 13.
  3. Sano T., Smith C. L., Cantor C. R. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates : [англ.] // Science. — 1992. — Vol. 258, no. 5079. — P. 120–122. — doi:10.1126/science.1439758.
  4. 1 2 Рязанцев и др., 2016, с. 378.
  5. 1 2 Рязанцев и др., 2016, с. 378–379.
  6. ↑ Chang et al., 2016, p. 16.
  7. 1 2 Chang et al., 2016, p. 15.
  8. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 390.
  9. ↑ Spengler et al., 2015, p. 6182.
  10. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 381.
  11. ↑ Chang et al., 2016, Fig. 1, A, p. 14.
  12. Ruzicka V., März W., Russ A., Gross W. Immuno-PCR with a commercially available avidin system // Science. — 1993. — Vol. 260, no. 5108. — P. 698–699. — doi:10.1126/science.8480182.
  13. Diamandis E. P., Christopoulos T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology : [англ.] // Clin. Chem.. — 1991. — Vol. 37, no. 5. — P. 625–636.
  14. Sano T., Smith C. L., Cantor C. R. Response : [англ.] // Science. — 1993. — Vol. 260, no. 5108. — P. 699. — doi:10.1126/science.260.5108.699.
  15. Niemeyer C. M., Adler M., Pignataro B., Lenhert S., Gao S., Chi L., Fuchs H., Blohm D. Self-assembly of DNA-streptavidin nanostructures and their use as reagents in immuno-PCR // Nucleic Acids Res. — 1999. — Vol. 27, no. 23. — P. 4553–4561.
  16. Zhou H., Fisher R. J., Papas T. S. Universal immuno-PCR for ultra-sensitive target protein detection : [англ.] // Nucleic Acids Res. — 1993. — Vol. 21, no. 25. — P. 6038–6039.
  17. Niemeyer C. M., Adler M., Wacker R. Detecting antigens by quantitative immuno-PCR : [англ.] // Nature Protocols. — 2007. — Vol. 2. — P. 1918–1930. — doi:10.1038/nprot.2007.267.
  18. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 386.
  19. Hendrickson E. R., Truby T. M., Joerger R. D., Majarian W. R., Ebersole R. C. High sensitivity multianalyte immunoassay using covalent DNA-labeled antibodies and polymerase chain reaction : [англ.] // Nucleic Acids Res.. — 1995. — Vol. 23, no. 3. — P. 522–529. — doi:10.1093/nar/23.3.522.
  20. ↑ Spengler et al., 2015, p. 6182–6183.
  21. ↑ Chang et al., 2016, Fig. 2, p. 15.
  22. Söderberg O., Gullberg M., Jarvius M., Ridderstråle K., Leuchowius K. J., Jarvius J., Wester K., Hydbring P., Bahram F., Larsson L. G., Landegren U. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation : [англ.] // Nat. Methods. — 2006. — Vol. 3, no. 12. — P. 995–1000. — doi:10.1038/nmeth947.
  23. Nam J. M., Park S. J., Mirkin C. A. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles : [англ.] // J. Am. Chem. Soc.. — 2002. — Vol. 124, no. 15. — P. 3820–3821. — doi:10.1021/ja0178766.
  24. Gong H., Holcomb I., Ooi A., Wang X., Majonis D., Unger M. A., Ramakrishnan R. Simple Method To Prepare Oligonucleotide-Conjugated Antibodies and Its Application in Multiplex Protein Detection in Single Cells : [англ.] // Bioconjugate Chemistry. — 2016. — Vol. 27, no. 1. — P. 217–225. — Open Access. — doi:10.1021/acs.bioconjchem.5b00613.
  25. Burbulis I., Yamaguchi K., Gordon A., Carlson R., Brent R. Using protein-DNA chimeras to detect and count small numbers of molecules : [англ.] // Nat. Methods. — 2005. — Vol. 2, no. 1. — P. 31–37. — doi:10.1038/nmeth729.
  26. Burbulis I., Yamaguchi K., Yu R., Resnekov O., Brent R. Quantifying small numbers of antibodies with a 'near-universal' protein-DNA chimera : [англ.] // Nat. Methods. — 2007. — Vol. 4, no. 12. — P. 1011–1013. — doi:10.1038/nmeth2127.
  27. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 389–390.
  28. ↑ Chang et al., 2016, p. 14.
  29. ↑ Spengler et al., 2015, p. 6183.
  30. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 393–396.
  31. ↑ Chang et al., 2016, p. 17–20.
  32. Niemeyer C. M., Wacker R., Michael Adler M. Combination of DNA-directed immobilization and immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of self-assembled DNA–protein conjugates : [англ.] // Nucleic Acids Res.. — 2003. — Vol. 31, no. 16. — P. e90. — doi:10.1093/nar/gng090.
  33. He J., Evers D. L., O'Leary T. J., Mason J. T. Immunoliposome-PCR: a generic ultrasensitive quantitative antigen detection system : [англ.] // J. Nanobiotechnology. — 2012. — Vol. 10, no. 1. — P. 26. — doi:10.1186/1477-3155-10-26.
  34. Lind K., Kubista M. Development and evaluation of three real-time immuno-PCR assemblages for quantification of PSA : [англ.] // J Immunol Methods. — 2005. — Vol. 304, no. 1–2. — P. 107–116. — doi:10.1016/j.jim.2005.06.015.
  35. Jiang X., Cheng S., Chen W., Wang L., Shi F., Zhu C. Comparison of oligonucleotide-labeled antibody probe assays for prostate-specific antigen detection : [англ.] // Anal. Biochem.. — 2012. — Vol. 424, no. 1. — P. 1–7. — doi:10.1016/j.ab.2012.02.004.
  36. Zhang H., Xu Y., Huang Q., Yi C., Xiao T., Li Q. Natural phage nanoparticle-mediated real-time immuno-PCR for ultrasensitive detection of protein marker : [англ.] // Chem. Commun.. — 2013. — Vol. 49, no. 36. — P. 3778–3780. — doi:10.1039/C3CC40688A.
  37. ↑ Chang et al., 2016, p. 20.
  38. Barletta J., Bartolome A., Constantine N. T. Immunomagnetic quantitative immuno-PCR for detection of less than one HIV-1 virion : [англ.] // J Virol. Methods. — 2009. — Vol. 157, no. 2. — P. 122–132. — doi:10.1016/j.jviromet.2008.12.013.
  39. Chen L., Wei H., Guo Y., Cui Z., Zhang Z., Zhang X. E. Gold nanoparticle enhanced immuno-PCR for ultrasensitive detection of Hantaan virus nucleocapsid protein : [англ.] // J. Immunol. Methods. — 2009. — Vol. 346, no. 1–2. — P. 64–70. — doi:10.1016/j.jim.2009.05.007.
  40. Deng M. J., Xiao X. Z., Zhang Y. M., Wu X. H., Zhu L. H., Xin X. Q., Wu D. L. A highly sensitive immuno-PCR assay for detection of H5N1 avian influenza virus : [англ.] // Mol. Biol. Rep.. — 2011. — Vol. 38, no. 3. — P. 1941–1948. — doi:10.1007/s11033-010-0315-8.
  41. Deng M., Long L., Xiao X., Wu Z., Zhang F., Zhang Y., Zheng X., Xin X., Wang Q., Wu D. Immuno-PCR for one step detection of H5N1 avian influenza virus and Newcastle disease virus using magnetic gold particles as carriers : [англ.] // Veterinary Immunology and Immunopathology. — 2011. — Vol. 141, no. 3–4. — P. 183–189. — doi:10.1016/j.vetimm.2011.02.018.
  42. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 392, 397.
  43. Huang S. H., Chang T. C. Detection of Staphylococcus aureus by a sensitive immuno-PCR assay : [англ.] // Clin. Chem.. — 2004. — Vol. 50, no. 9. — P. 1673–1674. — doi:10.1373/clinchem.2004.033548.
  44. Rajkovic A., El Moualij B., Uyttendaele M., Brolet P., Zorzi W., Heinen E., Foubert E., Debevere J. Immunoquantitative Real-Time PCR for Detection and Quantification of Staphylococcus aureus Enterotoxin B in Foods : [англ.] // Appl. Environ. Microbiol.. — 2006. — Vol. 72, no. 10. — P. 6593–6599. — doi:10.1128/AEM.03068-05.
  45. Halpern M. D., Jain S., Jewett M. W. Enhanced Detection of Host Response Antibodies to Borrelia burgdorferi Using Immuno-PCR : [англ.] // Clin. Vaccine Immunol.. — 2013. — Vol. 20, no. 3. — P. 350–357. — doi:10.1128/CVI.00630-12.
  46. Halpern M. D., Molins C. R., Schriefer M., Jewett M. W. Simple objective detection of human lyme disease infection using immuno-PCR and a single recombinant hybrid antigen : [англ.] // Clin. Vaccine Immunol.. — 2014. — Vol. 21, no. 8. — P. 1094–1105. — doi:10.1128/CVI.00245-14.
  47. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 399–400.
  48. 1 2 3 Chang et al., 2016, p. 21.
  49. ↑ Chang et al., 2016, p. 21–22.
  50. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 380.
  51. ↑ Chang et al., 2016, p. 22.
  52. ↑ Рязанцев и др., 2016, с. 402–403.
  • Рязанцев Д. Ю., Воронина Д. В., Завриев С. К. Иммуно-ПЦР: достижения и перспективы // Успехи биологической химии. — 2016. — Т. 56. — С. 377–410.
  • Chang L., Li J., Wang L. Immuno-PCR: An ultrasensitive immunoassay for biomolecular detection : [англ.] // Analytica Chimica Acta. — 2016. — Vol. 910. — P. 12–24. — doi:10.1016/j.aca.2015.12.039.
  • Spengler M., Adler M., Niemeyer C. M. Highly sensitive ligand-binding assays in pre-clinical and clinical applications: immuno-PCR and other emerging techniques : [англ.] // Analyst. — 2015. — Vol. 140, no. 18. — P. 6175–6194. — Open Access. — doi:10.1039/C5AN00822K.
  • Маерле А. В., Сергеев И. В., Алексеев Л. П. Метод иммуно-ПЦР: перспективы использования // Иммунология. — 2014. — Т. 35, № 1. — С. 44–48.

ru.wikipedia.org

ОТ ПЦР - это... Что такое ОТ ПЦР?

  • ПЦР правила — * ПЛР правілы * PCR rules правила, которым необходимо строго следовать при работе с использованием ПЦР метода. Эта необходимость продиктована высокой чувствительностью метода и требованием чистоты эксперимента, т. е. не допускать загрязнения… …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • ПЦР-гибридизация in situ — * ПЛР гібрыдызацыя in situ * PCR in situ hybridization or PCR PRINS вариант ПЦР, т. е. полимеразной цепной реакции (см.), когда ДНК амплифицируется и выявляется на морфологически интактных клетках или тканях. Для этого клетки или ткань… …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • ПЦР ISSR — * ПЛР ISSR * ISSR PCR or PCR of Inter Simple Sequence Repeats метод, суть которого заключается в том, что в качестве участков отжига праймеров используют микросателлитные локусы, а амплифицируют участки, находящиеся между их инвертированными… …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • ПЦР-кариотипирование — * ПЛР карыятыпаванне * PCR karyotyping метод идентификации отдельных хромосом с использованием ПЦР () со специфическими праймерами (см.), напр., с последовательностями Alu семейства альфоидной ДНК и др …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • ПЦР-технология — * ПЛР тэхналогія * PCR technology серия методов для амплификации (размножения) специфических сегментов ДНК и одновременно для модификации амплифицируемых последовательностей, напр., для введения мутаций при ПЦР мутагенезе и др. () …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • ПЦР — См. Реакция цепная полимеразная (Источник: «Словарь терминов микробиологии») …   Словарь микробиологии

  • ПЦР-кариотипирование — Метод идентификации отдельных хромосом с использованием полимеразной цепной реакции со специфическими затравками (например, к последовательностям Alu семейства, альфоидной ДНК и др.). [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо русский толковый словарь… …   Справочник технического переводчика

  • ПЦР — полимеразная цепная реакция …   Словарь сокращений и аббревиатур

  • ПЦР — Запрос «ПЦР» перенаправляется сюда. Cм. также другие значения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)  экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой… …   Википедия

  • ПЦР с обратной транскрипцией — Запрос «RT PCR» перенаправляется сюда; если вас интересует ПЦР в реальном времени (Real time PCR), или количественная ПЦР (quantitative PCR), см. ПЦР в реальном времени. В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной… …   Википедия

  • ПЦР в реальном времени — В молекулярной биологии, ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ. Real time PCR, qPCR)  лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, используется для одновременной амплификации и измерения… …   Википедия

  • dic.academic.ru

    ПЦР-диагностика. Что это?

    ПЦР-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования,широко применяющийся в диагностике инфекционных заболеваний. ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР (полимеразной цепной реакции).На сегодняшний день ПЦР -анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики.На базе клинической лаборатории создана ПЦР- лаборатория. ПЦР (полимеразная цепная реакция) -метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций "золотым стандартом". Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллиона других молекул. В настоящее время этот один из наиболее современных и совершенных лабораторных методов диагностики с успехом применяется при исследованиях специалистами клинической лаборатории СПбГУЗ"ГСПК".

    ПЦР — (Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) - расшифровывается как полимеразная цепная реакция.

    ПЦР диагностика — это метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, в частности, этот метод широко применяется и для диагностики заболеваний, передающихся половым путем.Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции. «Небольшой фрагмент ДНК» — это несколько сотен пар оснований ДНК , расположенных в строго определенной последовательности.Для ПЦР-диагностики инфекций достаточно небольшого фрагмента, поскольку любая ДНК включает в себя не менее нескольких тысяч оснований.При проведении ПЦР-анализа ведется поиск такого фрагмента ДНК инфекции, который специфичен только для данного микроорганизма. Это значит, что этот фрагмент ДНК «особенный» — он встречается только у этого микроба (или группы родственных микробов), но не встречается ни у одного другого микроба.Сама полимеразная цепная реакция (пцр диагностика) используется для того, чтобы найденный фрагмент размножить, клонировать: чтобы однозначно «увидеть» эти фрагменты ДНК, к окончанию реакции их должно быть не мене 1012 штук.

     История открытия ДНК и разработки метода ПЦР

    Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические.Также появлению ПЦР много способствовало открытие уникального фермента ДНК-полимеразы (или taq-полимеразы). Именно этот фермент катализирует и «контролирует» все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента — он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а «любимый» его температурный режим во время работы — 72оС. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре.

    В настоящее время метод ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики, предназначенных для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с каждым разом снижают себестоимость ПЦР-анализа, делая его доступным для широкого использования в диагностических и лечебных целях.

     Ежегодно появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей   различных заболеваний, так и мутаций генов человека.Официальное становление метода ПЦР в России связано с выходом в 1995 г. двух методических рекомендаций: "Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций методом цепной полимеразной реакции", в них ПЦР впервые рекомендована к применению в практическом здравоохранении; "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции". В 1995 г. была впервые подготовлена техническая документация (инструкции, технические условии.) и зарегистрирован в Минздраве России отечественной набор реагентов для ПЦР-диагностики. За прошедшие годы появилось большое количество модификаций ПЦР, позволивших значительно увеличить потенциальные возможности первоначально предложенного метода: мультипраймерная ПЦР, гнездовая ПЦР, ПЦР in situ, ПЦР в режиме реального времени . Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность и специфичность.  

     Изучение ДНК: строение, структура ДНК

     Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - универсальный носитель генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов. Открытие ДНК молекулы произошло в 1953 году. Френсис Крик и Джеймс Уотсон открыли структуру двойной спирали ДНК, их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией.ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из из последовательно соединенных нуклеотидов. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться (реплицироваться).В построении новой цепи активным "строителем" выступает специальный фермент - ДНК-полимераза.  Из одной молекулы ДНК образуются две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная. В основе анализа методом ПЦР лежит принцип репликации ДНК - синтеза ДНК, который современным ученым удалось воссоздать искусственно: в лаборатории врачи вызывают удвоение небольшого фрагментаДНК.   Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, другие биологические выделения, биоптаты.Забор материала производится в условиях процедурного кабинета лаборатории соответствующего профиля. После забора пробы вскоре должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию \ Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. \ В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее - природой его клеточной стенки.  Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "да" или "нет при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др.  Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным - в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена.

     Количественная оценка результатов ПЦР

    В ряде клинических ситуаций возникает вопрос о динамике патологического процесса и/или эффективности проводимой терапии. Эти вопросы наиболее актуальны при обследовании пациентов с хроническими инфекциями (гепатиты В ,С, вирус иммунодефицита человека Все большее развитие получает лабораторная диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) благодаря своей скорости и высокой чувствительности.

    Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний:

     Прямое определение наличия возбудителей.

    Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

    Высокая специфичность.

    Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

     Высокая чувствительность.

    Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток).

     .Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

    Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

     Высокая скорость получения результата анализа.

    Для проведения ПЦР- анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов 6.Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитарных агентов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды.В настоящее время метод ПЦР-диагностики интенсивно развивается.  Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа.Диагностика инфекционных заболеваний является наиболее частым приложением ПЦР в  медицинских учреждениях. Наиболее востребована ПЦР-диагностика вирусов (главным образом, вирусов гепатитов В и С, а также группы герпеса), а также возбудителей скрытых инфекций, передающихся половым путем (хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз и др.).

     ПЦР в диагностике инфекционных болезней

    Определить этиологию инфекции (т.е. какой именно микроорганизм или их сочетание вызвали воспалительный процесс). Для некоторых возбудителей, например,Mycoplazma genitalium, ПЦР – это единственный метод диагностики на сегодняшний день.Определить количество возбудителя. Особенно это актуально для условно-патогенных микроорганизмов,которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации).Осуществить контроль за течением инфекционного процесса и оценить эффективность лечения. Однако необходимо учитывать тот факт, что ПЦР может улавливать даже единичные фрагменты ДНК, которые могут оставаться некоторое время после лечения, в связи с чем, контроль эффективности проводимой терапии рекомендуется проводить не ранее чем через 2-3 недели после ее окончания.Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами. 

     ПЦР в диагностике гепатитов.

    В настоящее время известно как минимум 5 вирусов, способность которых вызывать поражение печени доказана. Это вирусы гепатита А, В, С, D, Е. В редких случаях гепатит может быть вызван вирусом Эпштейна-Барр, вирусом простого герпеса. Способность поражать печень таких агентов как вирус ТТ, вирус гепатита G сегодня признается не всеми. Все вышеперечисленные вирусы относятся к различным семействам, имеют разные биологические свойства и соответственно, тактика лечения будет тоже значительно отличаться в зависимости от этиологии гепатита.

    Вирусный гепатит А (ВГА): ПЦР используется для обследования контактных лиц и более раннего выявления заболевших гепатитом  В крови больного гепатитом А вирус присутствует гораздо дольше (иногда до нескольких месяцев), т.е. возможность заражения гепатитом А через кровь не ограничивается вышеуказанными сроками, и ПЦР единственный метод, с помощью которого возможно осуществлять мониторинг вирусемии (наличия вируса в крови)

    Вирусный гепатит В (ВГВ): в диагностике вирусного гепатита В ПЦР имеет свои неоценимые достоинства:

    Вирусный гепатит С (ВГС). Гепатит С редко протекает с ярко выраженными клиническими симптомами, чаще всего это случайные находки во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учитывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса (85%) и возможность развития цирроза печени), становится понятным, насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса. И именно ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С позволяя:

    Установить факт инфицированности гепатитом С. Это важно при обследовании контактных лиц, т.к. РНК ВГС появляется в крови больного гепатитом С гораздо раньше чем антитела, которые появляются как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серологического окна). Во-вторых, определение anti-HCV IgG методом ИФА в некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» результаты, поэтому обнаружении антител к вирусу гепатита С, рекомендуется подтверждать качественным обнаружением РНК , и в зависимости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК ВГС(при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа ВГС. Своевременно оценить эффективность проводимого лечения. Так, наиболее эффективными препаратами для лечения хронического гепатита С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12 неделе лечения.Оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК ВГС после окончания лечения, через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения.

    Диагностика вирусных гепатитов

     Гепатит А вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита А (HAV)

     В крови для диагностики определяют:

     anti-HAV-IgM - aнтитела к вирусу гепатита А класса IgM – маркер острой инфекции вирусом гепатита А

     anti-HAV-total - aнтитела к вирусу гепатита А суммарные классов IgM и IgG

     Гепатит В вызывается ДНК-содержащим вирусом гепатита В 

    В крови для диагностики определяют:HВsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В – основной маркер вирусного гепатита В или вирусоносительства;HBeAg - Hbe антиген вируса гепатита В – маркер активной репликации (размножения) вируса в органинизме;Anti-HBs - антитела к HBs антигену вируса гепатита В – маркер защитного иммунитета против вируса гепатита В, определяются также после вакцинации;  Anti-HBc-total - антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В суммарные классов IgM и IgG – маркер перенесенного или текущего гепатита В;Anti-HBc IgM - антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В класса IgM – маркер острого процесса; Anti-HВe - антитела к Hbeантигену вируса гепатита В – маркер перенесенного острого гепатита В, маркер ремиссии; ДНК вируса гепатита В качественное и количественное определение методом ПЦР 

     Гепатит С вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита С (HСV)

    В крови для диагностики определяют 

    anti-HСV-total - aнтитела к вирусу гепатита С суммарные классов IgM и IgG – маркер инфицирования вирусом гепатита С (перенесенного или текущего)

    РНК вируса гепатита С качественное и количественное определение методом ПЦР

    Генотипирование вируса гепатита С – для определения тактики и эффективности лечения, прогноза на будущее

     Гепатит D вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита D (HDV)

     Для диагностики применяется качественное определение РНК вируса методом ПЦР в крови.

    Гепатит G вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита G (HGV)

    Для диагностики применяется качественное определение РНК вируса методом ПЦР в крови.

     Гепатит TT вызывается ДНК-содержащим вирусом гепатита TT (TTvirus)

     Для диагностики применяется качественное определение ДНК вируса методом ПЦР в крови.

     ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции.

    В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход - обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) –anti-HIV  с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эффективность выявления лиц, инфицированных ВИЧ, с помощью данного подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для проведения ИФА и ИБ Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь косвенным маркером ВИЧ-инфекции, поэтому неудивительно, что в некоторых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации (период серологического «окна», который в среднем занимает от 2 до 6 месяцев). Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела не обнаруживались до 42 мес. с момента инфицирования. Кроме того, у пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к ВИЧ может значительно снижаться, что тоже приводит к ложноотрицательным результатам ИФА и ИБ.Практически все тест-системы для ИФА могут давать ложноположительные результаты. Объясняют это явление присутствием в крови антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех положительных в ИФА сывороток методом ИБ. Однако при исследовании таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов во время сероконверсии (периода ВИЧ-инфекции, когда начинают вырабатываться антитела, но их количество еще не достаточно для выявления), не удается получить однозначные результаты ИБ. Согласно рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при применении метода ИБ, должны быть повторно исследованы с использованием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного сомнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в течение 6 мес. и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для лиц, находящихся под таким наблюдением.Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практически до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1 года и более). С другой стороны, исчезновение антител к ВИЧ может быть вызвано гипоглобулинемией, являющейся следствием вызванного ВИЧ иммунодефицита, и поэтому не может быть основанием для снятия диагноза ВИЧ-инфекции. Поэтому такие дети должны находиться под наблюдением до 36 мес.Перечисленные выше проблемы иммуноферментной диагностики ВИЧ-инфекции могут быть решены с помощью ПЦР.

    vitalab99.ru

    Виртуальная ПЦР — Википедия

    Материал из Википедии — свободной энциклопедии

    Виртуальная полимеразная цепная реакция (ПЦР in silico, цифровая ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) — математический метод компьютерного анализа теоретической полимеразной цепной реакции, использующий данные о нуклеотидных последовательностях праймеров (или ДНК-зондов) для предсказания потенциальной амплификации фрагментов исследуемого генома, хромосомы, или любого другого участка ДНК[1][2][3][4][5][2].

    Этот инструмент используют для оптимизации подбора праймеров или ДНК-зондов к ДНК-мишени. Праймеры анализируются на наличие участков связывания и определяется степень их комплементарности к ДНК-мишени. Некомплементарные основания в участке связывания праймера с ДНК-мишенью снижают стабильность праймера, так как снижают температуру плавления, а также некомплементарные основания в 3'-конце праймера ингибируют инициацию синтеза ДНК в ПЦР с помощью ДНК-полимеразы Taq, которая не обладает корректирующей 3',5'-экзонуклеазной активностью. Если же некомплементарные основания находятся только на 5'-конце праймера и праймер стабилен при конкретной температуре отжига, то в этом случае Taq-полимераза будет использовать данный праймер как затравку для начала синтеза ДНК, комплементарной ДНК-мишени.

    Потенциально праймер с любой последовательностью нуклеотидных остатков найдёт комплементарные участки связывания на любой геномной ДНК про- или эукариот. Однако, полимеразная цепная реакция не будет проходить эффективно и синтез ПЦР-продукта будет проходить либо линейно (а не экспоненциально), либо не будет проходить вообще. Это связано, во-первых, с тем, что описано выше, для некомплементарных оснований на 3'-конце и стабильностью праймера; и во-вторых, для ПЦР необходимы два близко расположенных праймера, комплементарных обеим цепям и ориентированных 3'-концами друг к другу.

    Результат ПЦР in silico с помощью программы jPCR [1][6]. Показаны места отжига праймеров и потенциальный ПЦР-продукт

    Существует большое разнообразие программ для виртуальной ПЦР, различающихся по набору функций, простоте использования, эффективности и стоимости[7][8].

    Вероятно, наиболее широко используемыми являются инструмент «Electronic PCR» (электронная ПЦР)[7], представленный в свободном доступе на сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI), а также бесплатная программа компании PrimerDigital[9].

    С другой стороны, платная программа FastPCR [10] позволяет одновременно тестировать один праймер или набор праймеров (проб), предназначенных для амплификации множественных мишеней. Потенциальные ПЦР-продукты или сайты связывания праймеров могут быть предсказаны как для линейных, так и для кольцевых матриц, для стандартной, обратной или мультиплексной ПЦР. Программа вычислит температуру плавления для праймеров в участке связывания с ДНК-мишенью с некомплементарными основаниями и определит все потенциальные ПЦР-продукты. Можно также анализировать степень комплементарности и взаимодействие праймеров друг с другом.

    1. 1 2 Kalendar R., Lee D., Schulman A. H. Java web tools for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis (англ.) // Genomics : journal. — Academic Press, 2011. — Vol. 98, no. 2. — P. 137—144. — doi:10.1016/j.ygeno.2011.04.009. — PMID 21569836.
    2. 1 2 Yu B., Zhang C. In silico PCR analysis (неопр.) // Methods Mol Biol (англ.)русск.. — 2011. — Т. 790. — С. 91—107. — doi:10.1007/978-1-61779-176-5_6. — PMID 21779992.
    3. Schuler G. D. Sequence mapping by electronic PCR (англ.) // Genome Res (англ.)русск. : journal. — 1997. — Vol. 7. — P. 541—550. — doi:10.1101/gr.7.5.541. — PMID 9149949.
    4. Rotmistrovsky K., Jang W., Schuler G. D. A web server for performing electronic PCR (англ.) // Nucleic Acids Res (англ.)русск. : journal. — 2004. — Vol. ;32(Web Server issue). — P. W108—12. — doi:10.1093/nar/gkh550. — PMID 15215361.
    5. Bikandi J., San Millan R., Rementeria A., Garaizar J. In silico analysis of complete bacterial genomes: PCR, AFLP-PCR and endonuclease restriction (англ.) // Bioinformatics : journal. — 2004. — Vol. 20. — P. 798—790. — doi:10.1093/bioinformatics/btg491. — PMID 14752001.
    6. Kalendar R., Lee D., Schulman A. H. FastPCR software for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis. (англ.) // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). — 2014. — Vol. 1116. — P. 271—302. — doi:10.1007/978-1-62703-764-8_18. — PMID 24395370.
    7. 1 2 Electronic PCR (неопр.). NCBI - National Center for Biotechnology Information. Дата обращения 30 марта 2012.
    8. ↑ UCSC Genome Bioinformatics (неопр.). UCSC Genome Bioinformatics Group. Дата обращения 30 марта 2012. Архивировано 16 сентября 2012 года.
    9. ↑ jPCR (неопр.). PrimerDigital. Дата обращения 30 марта 2012. Архивировано 16 сентября 2012 года.
    10. ↑ FastPCR (неопр.). PrimerDigital Ltd. Дата обращения 30 марта 2012. Архивировано 16 сентября 2012 года.

    ru.wikipedia.org


    Смотрите также